實(shi)驗名稱：聲化(hua)學誘導艾(ai)氏腹水瘤細(xi)胞凋亡機(ji)制(zhi)初探

　　研究方向：生物醫學

　　測(ce)試目的(de)：

　　聲動力(li)學療法(fa)(Sonody namic therapy，SDT)是(shi)利用超聲(Ultrasound，Us)具有深部(bu)穿透(tou)及準確聚焦于生物組織局部(bu)的能力，激活相對無毒并且能在(zai)腫瘤細胞中(zhong)特異(yi)性富集的聲敏劑分(fen)子血(xue)卟啉(lin)衍(yan)生物，產生(sheng)具(ju)有高氧化活性(xing)的單線(xian)態氧等自(zi)由基(ji)，能有效地殺(sha)腫瘤(liu)細胞從而治(zhi)療(liao)癌癥的新方法。

　　學者主要提出超聲空化(hua)效應、單線態氧(yang)理論(lun)(lun)、自由基(ji)理論(lun)(lun)等，但聲動力學療法對腫(zhong)瘤細胞作用(yong)的生(sheng)物學機制仍不清楚(chu)。在(zai)超(chao)聲激活(huo)血卟啉殺傷癌細胞的研究中，通過(guo)掃描電鏡、透(tou)射(she)電鏡以及(ji)PI-HO和Annexin V-PI熒光雙染(ran)，觀察受損后(hou)細(xi)胞形態結構的變化，曾(ceng)發現處理后(hou)的S180和艾氏腹水腫瘤細胞(EAT)有核物質凝集、趨邊排列以及凋亡小體的形成等細胞凋亡特征，提示聲動力學療法不僅能直接殺傷腫瘤(liu)細胞，還可通過誘導腫瘤(liu)細胞凋亡(wang)來治(zhi)療癌癥。前期(qi)聲動力學療法抗癌的形態學研(yan)究發(fa)現，線粒體是較為敏感易變(bian)的細(xi)胞器(qi)之(zhi)一，它不僅是細胞的能量代謝中心，氧自由基的(de)重要產生部位，而(er)且與脊椎動(dong)物細胞(bao)凋亡的調控密切相關。本實驗采(cai)用頻(pin)率(lv)為1.43MHz，聲強為3.0W/cm²的高頻聚焦超聲(sheng)和濃(nong)度(du)為(wei)0.025mg/ml的血卟啉處理艾氏腹水腫瘤細胞，通過檢測3種促凋亡蛋白的表達、超氧化物歧化酶的活性以及膜脂質過氧化物的含量，研究超(chao)聲(sheng)激(ji)活血卟啉(lin)誘導(dao)艾(ai)氏腹水瘤細胞的(de)凋亡(wang)機(ji)制及其與氧自由基(ji)的(de)關系。

　　測試設備(bei)：ATA-M110高頻功率放大器模塊、昆明系小白鼠、艾氏腹水腫瘤細胞系、超聲探頭、血卟啉衍生物為單羥乙基單乙烯基次卟啉、細胞色素c和Bax單克隆抗體、caspase-3單克隆抗體、鏈霉卵白素SP試劑盒。

　　實驗過程(cheng)：

　　接種艾(ai)氏腹水腫瘤(liu)細(xi)胞于10只小鼠腹腔1周后，隨機取5只小鼠(其余5只備用)，抽取腹水(shui)細胞，分(fen)別置于(yu)醫用薄壁試管(guan)(含RPMI 1640+10%小牛(niu)血清培養基)，于37℃CO₂孵箱培(pei)養。實驗時(shi)用生理鹽(yan)水調整細胞濃度至3×10⁶cells/ml。每只小鼠抽取的(de)腹水(shui)細胞再分為4管(guan)，每管0.5ml細胞懸液，分(fen)別設為對照組(CT)、血卟啉組(H)、超聲組(Us)和超聲加血卟啉組(UH)。H組和UH組每管中加入血卟啉5μl，使其(qi)終濃度(du)為0.025mg/ml，37℃CO₂培養箱孵(fu)育45min，Us組和UH組分別在頻(pin)率為1.43MHz，強度為3.0W/cm²的超聲(sheng)(sheng)裝置中聲(sheng)(sheng)照處理3min。各實驗組分別于不同時間段取材處理。實驗重復3次，以確認實驗結果的穩(wen)定性。

　　免疫細胞化學檢測(ce)Bax，細胞色素c，caspase-3蛋白表達各實(shi)驗組(zu)分別于超聲(sheng)處理后(hou)0h，1h，3h取材(cai)。常(chang)規細胞涂片，丙酮固定10min，PBS洗滌3次，每次5min；含0.3%TritonX-100的PBS處理10min，以增加膜通透性，PBS洗滌(di)3次，每次5min；0.3%H₂O₂-甲醇于37℃處理15min，封閉內源性過氧化物(wu)酶，PBS洗滌3次，每次(ci)5min；正常山(shan)羊(yang)血清于37℃封閉30min，封閉非特異性結(jie)合位點(dian)；分別滴(di)加(jia)抗Bax、細胞色素c和caspase-3單克隆抗體(1∶100，1∶50，1∶500)，4℃孵育過夜(ye)，陰(yin)性對照組以0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)取代一抗；加入的(de)二抗為生物素標記羊抗兔IgG或生物素標記羊抗小鼠IgG，室溫孵育1h，PBS洗(xi)滌(di)3次，每次5min；滴加辣根酶標記鏈酶卵白(bai)素工作液，室溫孵育(yu)1h，PBS洗滌3次，每(mei)次(ci)5min；DAB顯色，梯度酒精脫水，中性(xing)樹(shu)膠封固蓋片。

　　實驗結果：

　　根據免(mian)疫細胞化學光鏡(jing)觀察(cha)結果和兩因素(su)重復(fu)測量方差(cha)分析可見，不同處理方法對Bax，細胞色素c和caspase-3蛋白有極顯著影響，不同取材時間(jian)對這三(san)種凋亡蛋白亦有極顯著影響。Tukey HSB法多重比(bi)較顯示：0h時各實驗組之(zhi)間無(wu)顯著性差異(yi)(P>0.05)；處理(li)1h時，UH組(zu)的3種(zhong)促(cu)凋亡(wang)蛋白(bai)表(biao)達均高(gao)于其它3個處理組(zu)(U，H和(he)CT組)，差異極顯(xian)著(P<0.01)；3h時(shi)，U組和UH組3種蛋(dan)白(bai)表達均比CT組和H組高，差異極顯著(P<0.01)，UH組(zu)的蛋白(bai)表達高(gao)于U組(zu)，差(cha)異(yi)極顯(xian)著(P<0.01)。而3種促凋亡蛋白表達的時滯效應分析結果也表明：各(ge)實(shi)驗組中CT和H組的3種促凋亡蛋白隨時間延長表達量無顯著變化；U組的蛋白表(biao)達(da)量在處(chu)理3h時顯著升高；UH組(zu)的(de)蛋白表(biao)達量隨時間延長持續升(sheng)高(平均光密(mi)度值(zhi)表(biao)示陽性(xing)細胞蛋白表(biao)達強度，平(ping)均(jun)光密度值越小(xiao)則表達信號越強)。

　　EAT細胞(bao)中SOD活力(li)和(he)MDA水平測定結果，超聲+血卟啉處理EAT細胞后1h取材，發(fa)現與CT和H組相比，U組的SOD活(huo)力略(lve)有降低，但不顯著(P>0.05)，細胞膜脂(zhi)質過氧化水(shui)平(ping)無顯著變化(P>0.05)，UH組(zu)的SOD活力顯著降低，細胞(bao)膜脂質過(guo)氧化水平(ping)顯著升(sheng)高。(P<0.01)

　　表(biao)1：Tukey HSB法對(dui)不同取材(cai)時間Bax、細胞色素(su)c和(he)caspase-3平均光密(mi)度值(×10^-4)的多(duo)重比較

　　圖1：不(bu)同(tong)時(shi)間段取材(cai)各組Bax蛋白平均光密度值變化

　　圖(tu)2：不同時間段取材各組細胞色素c蛋白平均光密度值變化

　　安泰ATA-M110高頻功率放大器模塊：

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