實(shi)驗名稱：超聲激活血卟啉對(dui)S180腫瘤細胞表面EGFR表達量的影響

　　研究(jiu)方向(xiang)：生物(wu)醫療

　　測試目的(de)：

血卟啉是從血紅蛋白中提取的(de)有機光敏劑，其本身無抗腫(zhong)(zhong)瘤效應，但它(ta)可以(yi)在動物和人的(de)多種(zhong)腫(zhong)(zhong)瘤組織優先(xian)聚集，易為聲(sheng)光輻射處(chu)理激(ji)活(huo)(huo)，當它(ta)被聲(sheng)光激(ji)活(huo)(huo)后能產(chan)生強烈的(de)抗腫(zhong)(zhong)瘤效應。美國(guo)利用(yong)光激(ji)活(huo)(huo)治療(liao)腫(zhong)(zhong)瘤，這種(zhong)方法被稱為光動力(li)學(xue)療(liao)法，簡(jian)稱PDT。光動力學療法在臨床主要應用于人體表面淺層腫瘤的治療。光在生物組織中的穿透能力差，使其對深部腫瘤的治療受到限制。超聲聯合血卟啉對小鼠移植腫瘤生長抑制有協同(tong)效(xiao)(xiao)應，發現(xian)單(dan)用(yong)(yong)血卟啉無抑制作用(yong)(yong)，單(dan)用(yong)(yong)超聲(sheng)僅有(you)輕微抑制作用(yong)(yong)，而兩者聯(lian)合則有(you)明顯的抑制效(xiao)(xiao)果，并將(jiang)之命名為聲(sheng)動力(li)(li)學療法。超聲(sheng)是一(yi)種彈性(xing)機(ji)械波，其在生(sheng)物(wu)組織中(zhong)的穿透能力(li)(li)比激光(guang)強(qiang)，同(tong)時超聲(sheng)能夠聚焦(jiao)于特定(ding)部位。聲(sheng)動力(li)(li)療法對(dui)(dui)于治療腫瘤(liu)細胞(bao)有(you)較強(qiang)的針對(dui)(dui)性(xing)，對(dui)(dui)正常組織無創(chuang)傷，組織穿透力(li)(li)強(qiang)，并且機(ji)體不產生(sheng)耐受(shou)性(xing)，可以反復多(duo)次(ci)治療，因而它對(dui)(dui)于治療腫瘤(liu)，特別是組織深層腫瘤(liu)有(you)著較好(hao)的應用(yong)(yong)前景。有(you)學者認為SDT殺死(si)或(huo)抑制腫瘤細胞的(de)部分機理是(shi)通過(guo)超聲的(de)熱(re)效(xiao)應(ying)來實現的(de)，但是(shi)大量的(de)實驗結果提(ti)示(shi)，SDT可能(neng)更主(zhu)要(yao)地與超(chao)聲(sheng)激活聚(ju)集在癌組(zu)織的血卟啉產(chan)生單(dan)線態(tai)氧有(you)關。

　　測(ce)試設備：ATA-8202射頻功率放大器、昆(kun)明系小白鼠、艾氏(shi)腹水腫瘤細胞系、超聲探頭、血卟啉(lin)衍生物為(wei)單(dan)(dan)羥乙基(ji)(ji)單(dan)(dan)乙烯(xi)基(ji)(ji)次卟啉(lin)、細胞色素c和Bax單(dan)(dan)克(ke)隆抗體(ti)、caspase-3單(dan)(dan)克(ke)隆抗體(ti)、鏈霉卵白素SP試劑盒。

　　實驗過程：

　　接(jie)種：S180腹水瘤細(xi)胞于6只小(xiao)鼠(shu)腹腔1周后(hou)，隨機取3只小(xiao)鼠(shu)，抽取(qu)腹水細(xi)胞，分別(bie)置(zhi)于醫用薄壁試(shi)管，加(jia)入RPMI1640+10%小牛血清培養基中，于37℃孵箱培養(yang)，實驗(yan)時(shi)用生理鹽(yan)水(shui)調(diao)整細(xi)胞濃度至2x10⁶個/ml。每只小鼠抽取的腹水細胞分為12管，分(fen)為四(si)組(zu)，分(fen)別為對照(zhao)組(zu)(CT)、血卟啉組(zu)(H)、超聲組(U)和超聲加血卟啉組(UH)，每(mei)組三管，每管(guan)0.5ml細胞懸液(ye)。H組和UH組每管中加入血卟(bu)啉4ul，使(shi)其(qi)終濃度為0.01mg/ml，37℃CO₂孵箱孵育，45min后U組和UH組分別在頻率為1.8MHz，強度為2W/cm²的超聲(sheng)裝置中聲(sheng)照處理3min，各實驗組分別于聲照后1h、3h、5h取材，常規細胞涂片(pian)。

　　免疫組(zu)織(zhi)化學染色：以SP法進行免疫組織化學染色：細(xi)胞涂片固定后加3%過氧化氫處理15min，除去內源性(xing)酶(mei)PBS洗3次，加正常動物血清(qing)30min以減少非特異性染色，加EGFR一抗4℃過(guo)夜，PBS代替一抗作為陰性對照。SP染色按試劑盒說明進行，DAB顯色，梯度酒(jiu)精脫水(shui)，中性樹膠封固蓋片(pian)。

　　陽性結果觀察(cha)：各組隨(sui)機選取10個高倍視野，利用數碼顯微成像系統進行圖像采集和分析。Image Pro-Plus5.0圖像分析軟件測定各組照片的平均光(guang)密度OD值(0~255)(用平均光(guang)密度表示陽(yang)性(xing)細胞表達強度，平均光(guang)密度值越大(da)則表達越強)。組間t檢驗顯示組間差異(yi)。

　　實驗(yan)結果(guo)：

　　由表中數(shu)據(ju)可(ke)以(yi)看出，超(chao)聲激活血卟啉(lin)處理1h后，UH組、U組平均光(guang)密(mi)度(du)(du)值明顯低于CT組、H組，且UH組平均光(guang)密(mi)度(du)(du)值低于U組，經(jing)組間(jian)t檢驗，UH組與其它(ta)組差異(yi)極顯著(p<0.01)；超(chao)聲激活血卟啉處(chu)理(li)3h后，UH組平均光密度值小幅度下降，CT組、H組基本無變化，U組平(ping)均光密度下降，經組間t檢驗，UH組與可組差異顯著(P<0.05)；UH組與CT組、H組差異極顯著(p<0.01)；超聲激活血(xue)卟啉處(chu)理5h后，UH組平均光密度值下降，其它組基本無變化，UH組與其它組差異極顯著(p<0.01)(表1)。由圖可知，UH組(zu)、U組(zu)平均(jun)光密度(du)值明顯低于H組(zu)和CT組(zu)，隨時間延長U組(zu)、UH組(zu)變化顯著。

　　表1EGFR在超聲處理1h、3h、5h后平均光密度值比較(*10^-2)

　　圖1EGFR在超聲處理1h、3h、5h后平均光密度值比較(*10^-2)

　　安(an)泰ATA-8202射頻功率放大器：

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