實驗名稱：CPLX1基(ji)因(yin)和PV+抑制(zhi)性神經元(yuan)在超聲感知中(zhong)的作用(yong)

　　研究方向：對(dui)于一些哺乳動物(wu)(wu)物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)來說(shuo)，超聲(sheng)波感知(zhi)在(zai)(zai)日(ri)常(chang)生活中(zhong)是(shi)必不可(ke)少的(de)(de)。例如(ru)，回聲(sheng)定(ding)位微(wei)型(xing)(xing)(xing)蝙(bian)蝠和齒(chi)鯨(jing)使(shi)用(yong)超聲(sheng)波進(jin)行(xing)導航(hang)和定(ding)位獵物(wu)(wu)，而(er)老鼠和大鼠則使(shi)用(yong)超聲(sheng)波進(jin)行(xing)社交(jiao)交(jiao)流。然而(er)，目前尚不清(qing)楚(chu)大腦如(ru)何感知(zhi)超聲(sheng)。蝙(bian)蝠有1,400多種(zhong)(zhong)物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)和最寬的(de)(de)聽(ting)覺靈敏度頻(pin)率范(fan)圍（從8kHz到200kHz以上），是(shi)研究(jiu)哺乳動物(wu)(wu)超聲(sheng)感知(zhi)的(de)(de)理想(xiang)物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)。根(gen)據(ju)形態，蝙(bian)蝠可(ke)分(fen)為(wei)(wei)微(wei)型(xing)(xing)(xing)蝙(bian)蝠和巨(ju)型(xing)(xing)(xing)蝙(bian)蝠。微(wei)型(xing)(xing)(xing)蝙(bian)蝠使(shi)用(yong)超聲(sheng)波回聲(sheng)定(ding)位在(zai)(zai)太(tai)空中(zhong)導航(hang)和覓食，而(er)巨(ju)型(xing)(xing)(xing)蝙(bian)蝠主要在(zai)(zai)日(ri)常(chang)生活中(zhong)使(shi)用(yong)它們發達的(de)(de)視覺和對(dui)人類(lei)可(ke)聽(ting)聲(sheng)音的(de)(de)感知(zhi)。因(yin)此，物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)和聽(ting)覺頻(pin)率范(fan)圍的(de)(de)多樣(yang)性使(shi)蝙(bian)蝠成為(wei)(wei)研究(jiu)超聲(sheng)感知(zhi)分(fen)子機(ji)制(zhi)的(de)(de)獨特(te)模(mo)型(xing)(xing)(xing)。

　　超(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)感(gan)知(zhi)對(dui)于(yu)(yu)許多哺乳動(dong)物至關(guan)(guan)重要(yao)，例(li)如具有回聲(sheng)(sheng)(sheng)定位能力的(de)(de)小(xiao)(xiao)蝙(bian)蝠和齒鯨利用超(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)進行導航和定位獵物，而(er)小(xiao)(xiao)鼠(shu)和大鼠(shu)則利用超(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)進行社交(jiao)活動(dong)。聽覺(jue)皮(pi)(pi)層作為從聽覺(jue)場(chang)景到感(gan)知(zhi)表征的(de)(de)轉換場(chang)所，對(dui)于(yu)(yu)產生(sheng)更高(gao)級的(de)(de)認知(zhi)信息至關(guan)(guan)重要(yao)。然而(er)，關(guan)(guan)于(yu)(yu)聽覺(jue)皮(pi)(pi)層中超(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)感(gan)知(zhi)的(de)(de)研究相對(dui)較少(shao)。因此，本(ben)研究旨在通過(guo)構建蝙(bian)蝠的(de)(de)高(gao)質量參考基(ji)因組(zu)和聽覺(jue)皮(pi)(pi)層的(de)(de)單細胞圖(tu)譜，鑒定與超(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)感(gan)知(zhi)相關(guan)(guan)的(de)(de)細胞類群和標志基(ji)因，揭示超(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)感(gan)知(zhi)的(de)(de)分子機制。

　　實驗目的：通過深(shen)入探(tan)索CPLX1基(ji)因和PV+抑制性(xing)神經元(yuan)在超聲(sheng)感(gan)知中的作(zuo)用，揭示(shi)哺乳動物超聲(sheng)感(gan)知的分子機制，為改(gai)善(shan)衰老相(xiang)關聽力損(sun)失提供線索，同時也為利用單細胞組學研(yan)究特質動物的獨特形狀提供范例(li)。

　　測試設備：ATA-3090B功率(lv)放大器、信(xin)號發(fa)生器、揚聲(sheng)器、示波(bo)器

　　實驗過程：本實驗采用XR-XC404調(diao)節系統對注射立體定向AAV3周(zhou)后的成年(nian)雄性小(xiao)鼠(shu)進行。將每只小(xiao)鼠(shu)置于(yu)(yu)個位于(yu)(yu)隔音(yin)(yin)隔間(jian)的操作箱中，允(yun)許(xu)其(qi)自由(you)探(tan)索2分(fen)鐘。播放三(san)種音(yin)(yin)調(diao)(70-90dBSPL，16或63khz，持續(xu)30秒，并(bing)以(yi)(yi)0.4mA，2s的電擊間(jian)隔1分(fen)鐘。在(zai)波形發生器(qi)中產生純音(yin)(yin)，再由(you)功率放大(da)器(qi)ATA-3090B功率放大(da)器(qi)供電，并(bing)在(zai)放置在(zai)地(di)板(ban)上方(fang)15厘米的超聲波揚聲器(qi)中播放。24小(xiao)時后，小(xiao)鼠(shu)進行兩次(ci)連(lian)續(xu)測(ce)試:改變語(yu)境測(ce)試和音(yin)(yin)調(diao)測(ce)試。具體來說，改變意味著老(lao)鼠(shu)被轉移(yi)到(dao)(dao)另一個環(huan)境中，以(yi)(yi)限制環(huan)境的影響。將小(xiao)鼠(shu)轉移(yi)到(dao)(dao)改變的盒子(zi)中4分(fen)鐘，以(yi)(yi)測(ce)量凍結行為(wei)，之后播放純音(yin)(yin)(70-90dBSPL，16或63kHz)1分(fen)鐘以(yi)(yi)測(ce)試聲音(yin)(yin)期(qi)間(jian)的凍結程度。為(wei)了改造改造后的盒子(zi)，將金屬網格地(di)板(ban)替(ti)換(huan)為(wei)塑(su)料板(ban)，在(zai)白色(se)塑(su)料墻上涂(tu)上紅色(se)條(tiao)紋(wen)，并(bing)用3%醋酸代(dai)替(ti)20%乙醇(chun)的背景氣味。

　　圖(tu)1-1：CPLX1基因和PV+抑制(zhi)性神經(jing)元在超聲感知中(zhong)的作用實驗框圖(tu)

　　實驗結果：通過跨物種比較發現(xian)(xian)，Parvalbumin（PV）+抑制性(xing)神(shen)經(jing)元在(zai)(zai)(zai)小(xiao)(xiao)蝙(bian)(bian)(bian)蝠(fu)和大蝙(bian)(bian)(bian)蝠(fu)之(zhi)間存在(zai)(zai)(zai)顯(xian)著(zhu)(zhu)差(cha)異。光纖鈣(gai)成(cheng)像實驗表(biao)(biao)明，PV+抑制性(xing)神(shen)經(jing)元對63kHz超聲信(xin)號(hao)(hao)表(biao)(biao)現(xian)(xian)出(chu)明顯(xian)的(de)(de)鈣(gai)信(xin)號(hao)(hao)反應。在(zai)(zai)(zai)小(xiao)(xiao)鼠行為學實驗中(zhong)，沉默PV+抑制性(xing)神(shen)經(jing)元會導(dao)致(zhi)小(xiao)(xiao)鼠無(wu)法感(gan)知(zhi)(zhi)超聲信(xin)號(hao)(hao)，這表(biao)(biao)明聽覺皮(pi)層(ceng)中(zhong)的(de)(de)PV+抑制性(xing)神(shen)經(jing)元與超聲感(gan)知(zhi)(zhi)有(you)關。在(zai)(zai)(zai)聽覺皮(pi)層(ceng)PV+抑制性(xing)神(shen)經(jing)元中(zhong)，小(xiao)(xiao)蝙(bian)(bian)(bian)蝠(fu)的(de)(de)CPLX1基(ji)因（編碼complexin-1蛋白）表(biao)(biao)達水平顯(xian)著(zhu)(zhu)高于(yu)大蝙(bian)(bian)(bian)蝠(fu)。對小(xiao)(xiao)鼠Cplx1進(jin)行擾動實驗發現(xian)(xian)，這嚴重(zhong)影響了其超聲感(gan)知(zhi)(zhi)能力。研究還發現(xian)(xian)，CPLX1在(zai)(zai)(zai)小(xiao)(xiao)蝙(bian)(bian)(bian)蝠(fu)的(de)(de)整個聽覺環路(lu)中(zhong)發揮作用，但在(zai)(zai)(zai)大蝙(bian)(bian)(bian)蝠(fu)中(zhong)則不然(ran)。

　　圖1-2暴露于16kHz至63kHz，代表(biao)性個體小鼠(shu)GCaMP信號(hao)的熱(re)圖。熱(re)圖按(an)ΔF/F(%)排序。色階表(biao)示AF/F(%)。

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　　圖：ATA-3090C功率放(fang)大(da)器指標參數

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